制定背景

• 疾病现状：全球重要致盲眼病，我国患病率高，医源性感染上升，病原检出率低
• 技术原理：基于PCR及核酸序列分析，如qPCR、mNGS、多重PCR与微阵列平台
• 共识目的：推动诊疗转型，提供实验室支持，提升诊治水平
• 制定方法：改良德尔菲法，综合相关指南、研究及经验
• 结果解读：需结合临床背景，避免过度或不足治疗

常见感染性角膜炎病原体及送检指征

细菌性角膜炎

• 起病特征：急骤，常见于外伤、戴镜、术后或免疫抑制患者
• 主要病原体：革兰阳性菌、革兰阴性菌
• 送检指征：疑似病例先刮片染色及培养
• 分子诊断：初治典型病例不常规用；治疗无效、涂片阳性培养阴性等情况推荐，可选16S rRNA基因PCR/测序或mNGS

真菌性角膜炎

• 起病特征：相对隐匿，多有植物外伤或用激素史
• 主要病原体：丝状真菌、酵母菌
• 送检指征：高风险因素且符合表现或治疗无效者先刮片检查
• 分子诊断：涂片疑似培养阴性、需鉴定菌种等情况推荐，可选真菌通用PCR、种属特异性PCR或mNGS

病毒性角膜炎

• 起病特征：反复发作，不同病毒有不同表现
• 主要病原体：疱疹病毒科
• 送检指征：典型病例临床诊断，需确诊、鉴别等情况检测
• 分子诊断：首选qPCR，不典型或罕见病例考虑mNGS

棘阿米巴角膜炎

• 起病特征：病程迁延，痛觉分离，高危因素为戴镜
• 主要病原体：棘阿米巴原虫
• 送检指征：接触镜相关或外伤后治疗无效或IVCM发现特征时检测
• 分子诊断：镜检和培养敏感性有限，18S rDNA分子检测在疑似阴性、IVCM未发现等情况强烈推荐，培养与分子检测互为辅助

标本采集及质量评估

标本采集及转运原则

• 标本采集原则：即刻送检、优先涂片、床旁接种，不同部位样本采集方法和要求不同
• 分子检测样本的防污染采集原则：人员与物品、操作环境与顺序、麻醉剂与染色剂、样本容器、转运隔离等方面严格防污染
• 角膜溃疡标本由经验丰富医师刮取；角膜组织及活检材料切碎接种；眼内标本手术获取；眼内液检测用于特定病例，采集由有经验医师在无菌条件下完成，控制抽取量，样本转运方式有要求；非临床样本微生物学检测需审慎解读结果

标本质量评估

• 实验室原则：不轻易拒收样本，尽可能完成检验并与临床沟通，标本质量评估遵循标准流程
• 刮片标本细胞学评估：制成均匀薄层涂片，不同标本涂片制备方式不同，组织标本和角膜刮片有合格标准，细胞学分级标准适用于眼内标本
• 培养标本质量控制：全过程管理，评估多项关键环节及检测项目适宜性，存在缺陷标本不拒收但报告说明局限性

各环节规范

• 核酸提取：推荐使用经临床验证的商品化核酸提取试剂盒及自动化提取仪，如 EZ1 病毒小量试剂盒（V2.0）在 EZ1 advanced XL 仪器上提取，洗脱体积 60 - 120 μl，每批次提取设阴性质控。
• 靶标选择与质控：针对不同病原体采用验证的特异性基因靶标扩增，每次检测含内参基因监控核酸提取效率及抑制物。
• 标本送检：临床医师送检明确标注检测项目及优先级。

实验室分子诊断

细菌性角膜炎

• 16S rRNA 基因测序：鉴定难培养或非典型细菌，但不适用于角膜样本病原初筛，传统桑格测序和 16S rDNA 克隆文库法有局限。
• mNGS：全面揭示病原体谱，适用于难治性角膜炎，但假阳性率高，解读需综合判断，推荐结合涂片镜检。
• 种属特异性 qPCR 或耐药基因 PCR：用于怀疑特定病原体或识别耐药基因时。

真菌性角膜炎

• ITS 区 PCR 与测序：区分常见致病菌，但真菌细胞壁影响 DNA 提取效率，需规范 DNA 提取方法，结合临床背景解读结果。
• mNGS：适用于罕见真菌或混合感染诊断。
• MLST 等：用于医院感染暴发调查和流行病学溯源。
• 新型检测技术：如 RID - MyC 在资源有限场景及疑难病例筛查有潜力。

病毒性角膜炎

• qPCR：首选方法，高灵敏度、特异性和可定量，样本类型影响检出率，结果需结合临床表现解读，用于监测疗效和病毒载量变化，结合测序分析病毒基因型及耐药突变。
• 新技术：MDH assay 用于混合感染鉴别；ICGA 为门诊提供初步诊断；泪膜抗体/抗原检测作为补充手段。

阿米巴角膜炎

• qPCR：最敏感和特异的诊断方法之一，检测滋养体和包囊，用于早期诊断和疗效评估，是确诊关键工具。
• mNGS：用于疑难病例诊断及虫株种属鉴定，诊断效能待验证。

分子诊断结果的解读与报告规范

通用原则

• 解读核心：区分病原体致病状态与定植/污染，阳性结果结合多要素综合评判。

细菌性角膜炎

• 阳性判断阈值：qPCR 的 Ct 值基于试剂和平台验证确定，不同 Ct 值结果解读不同；基于特定试剂和平台，经严格性能验证确定，较低 Ct 值（≤30）提示高核酸载量与急性感染相关
• 测序数据要求：保证 16S rRNA 基因测序和 mNGS 报告病原体序列数据质量；16S rRNA 基因测序保证数据质量与可靠性，mNGS 报告病原体需有显著相对丰度或统计学显著性
• 结果解读：临床医生结合体征解读，不一致时以临床表现为主，必要时传统方法验证；结合患者体征解读，不一致时以临床表现为主
• 报告内容：标注检测方法，报告病原体种类与载量，结果解释与临床建议，对条件致病菌解读谨慎；标注检测方法，报告病原体种类、载量信息，结果解释与临床建议，对条件致病菌谨慎解读

真菌性角膜炎

• 阳性判断阈值：基于 ITS 区的 qPCR 的 Ct 值由实验室自行建立确定；基于 ITS 区的 qPCR 由实验室自行建立确定
• 结果解读：结合临床表现、角膜刮片镜检或真菌培养结果，mNGS 阳性结果判定遵循规范化流程
• 结果与临床表现一致性分析：典型体征结合 PCR 阳性确立诊断，PCR 阳性但病灶为细菌性溃疡特征需怀疑交叉污染
• 检测报告内容：标注检测方法，报告菌属及相对载量，结果解释与临床建议，对条件致病菌审慎解读

病毒性角膜炎

• 诊断标准：qPCR 检测病毒 DNA 以 Ct 值 ≤36 为阳性，<30 提示活动性复制；房水样本中 CMV DNA 载量 ≥10^4 copies/ml 有诊断意义
• 结果与临床表现一致性分析：上皮型树枝状溃疡与 HSV - DNA 阳性高度一致；房水 CMV - DNA 阳性确诊 CMV 内皮炎；病毒载量与疾病活动度相关
• 检测报告内容：标注检测方法，报告具体病毒类型及定量值，结果解释与临床建议，对条件致病菌谨慎解读

阿米巴角膜炎

• 诊断标准：18S rDNA qPCR 以 Ct 值 ≤35 为阳性，序列匹配度 ≥99%；mNGS 棘阿米巴序列数显著高于背景且经 PCR 验证
• 结果与临床表现一致性分析：环形浸润、放射状神经炎与 PCR 阳性高度相关；包囊期载量低但有诊断价值；治疗后载量下降缓慢提示包囊残留
• 检测报告内容：标注检测方法，结果解释与临床建议，对条件致病菌格外谨慎

小结

• 诊疗路径：眼科医师评估眼部病变，精准选择染色及培养策略；实验室与临床沟通分析结果差异原因；综合考虑脓性标本培养阴性的影响因素
• 分子诊断优势：高灵敏度与特异性，提升诊断效能；mNGS 提高疑难病例诊断率，揭示混合感染；qPCR 或多重 PCR 实现快速鉴定与耐药基因分析
• 协作机制：临床医师掌握标本采集技术，推行床旁接种；实验室建立多元化检测平台
• 抗感染治疗：常规药敏试验折点标准不适用于眼科局部用药；治疗方案依赖临床经验、流行病学及耐药监测结果
• 结果解读：强化审慎解读，避免临床决策风险
• 共识修订：定期修订更新，提供更多临床获益